明万历二十七年（1599年），耶稣会士利玛窦到南京传教。次年，南京教友达100余人。礼部尚书兼文渊阁大学士徐光启以及常熟名绅瞿太素，先后于万历三十一年和万历三十三年，在南京受洗入教。万历四十三年，意籍传教士王丰肃在崇礼街附近建1座教堂，次年在南京教案中被拆毁，王等人被押解到澳门。崇祯元年（1628年），意籍传教士阳玛诺、毕方济到南京，逐步恢复了南京教务。至清顺治十五年（1658年），南京已成为中国天主教的教务中心。次年教宗下诏建立中国北部代牧区后，宗座代牧就驻南京。道光二十六年（1846年），皇帝谕令“解禁”，法籍传教士薛孔昭任南京第1任本堂神父，有教友395人。同治三年（1864年）十二月，法籍传教士雷遹俊任南京总铎（南京教区西部总铎区）。同治九年，建成“圣母无染原罪始胎堂”（南京石鼓路天主堂）。光绪二十六年至民国16年间（1900-1927年），先后在下关天保里和句容、溧水、江宁等地建堂。

民国16年（1927年），北伐军进城，石鼓路天主堂被毁。次年，国民政府拨款15万元重新修复。民国22年（1933年），南京教区改为中国籍主教区，石鼓路天主堂定为主教座堂。日军侵华战争期间，教务中断。1945年罗马教廷派美国耶稣会士牧育才等人到南京恢复教务。天主教南京教区历任主教为：罗文藻主教。1936年罗马教廷委任于斌为主教。抗日战争开始后于斌去重庆，委托张四维（又名张禄加）副主教代理其工作。抗日战争胜利后，于斌在1946年5月回到南京，1948年升为总主教，同年底去台湾。罗马教廷公使黎培里任命斐效远（比籍）任副主教。1951年7月，黎培里任命李维光为南京教区代主教，1958年自选自圣为主教。1981年7月9日，钱惠民被选为南京教区主教，并于同年7月24日在北京由济南教区宗怀德主教祝圣晋牧。1993年12月，刘元仁为南京教区正权主教（宗怀德主教祝圣）。2000年1月6日，陆新平为南京教区助理主教（刘元仁主教祝圣），2005年为南京教区主教。

1992年，南京教区辖3个总铎区，即南京总铎区、常州总铎区和无锡总铎区。下辖16个本堂区。主教钱惠民，有21位神父，约10万教友。

目前，南京教区主教1人，神父23人，修女19人。开放的主要教堂有：南京石鼓路天主堂、碧瑶天主堂、江宁陶吴天主堂、无锡天主堂、西漳天主堂、太湖天主堂、鹅湖天主堂、江阴南门天主堂、江阴青阳天主堂、陆桥天主堂、宜兴天主堂、常州天主堂、天宁郑陆天主堂、溧阳上黄天主堂、镇江丹阳天主堂等。